اساس مولکولی ژنتیک باکتری ها

    از دیدگاه ژنتیکی یکی از خصوصیات تمام اشکال حیات، ثبات عمومی یا مشابهت در صفات زاده ها و والدین است. زیرا صفات ارثی در حین انتقال ثابت می مانند. به هر حال علاوه بر توارث صفات که موجب ثبات گونه ها میشود، در زاده ها تغییراتی نیز بروز می کند. این تغییرات با دو خاصیت اصلی سلول یعنی ژنوتیپ و فنوتیپ رابطه دارد. ژنوتیپ عبارت است از ریخت ژنتیکی یک موجود و فنوتیپ عبارت است از تظاهر ژنوتیپ یاخته یا ارگانیسم بصورت صفات قابل مشاهده. تغییرات فنوتیپی ممکن است ناشی از تغییرات در ژنوتیپ باکتری باشد. تغییرات ژنوتیپی به یکی از صورت های کلی زیر ایجاد می شود:

    جهش (موتاسیون = Mutation)

    نوترکیبی (Recombination)

جهش

    جهش یا موتاسیون عبارت است از تغییر ردیف نوکلئوتیدهای یک ژن. این تغییر موجب پیدایش یک ژنوتیپ جدید می شود. به اورگانیسمی که آثار جهش را در خود نشان دهد جهش یافته یا موتانت (mutant) گویند. موتاسیون ها وقایعی هستند که به ندرت و بطور اتفاقی می افتند. در جهان باکتری ها از میان یک میلیون تا صد میلیون باکتری، یکی ممکن است دستخوش موتاسیون گردد.

انواع موتاسیون ها

    دو نوع معمول موتاسیون عبارت است از:

    موتاسیون نقطه ای (Point Mutation)

    موتاسیون برهم زننده ی کدها (Frame shift Mutation)

موتاسیون نقطه ای:

    اگر در یک ردیف بازهای یک ژن، یک نوکلئوتید خاص جانشین نوکلئوتید دیگر شود، موتاسیون نقطه ای بوجود می آید. در موتاسیون نقطه ای اگر یک باز پورین (مثل آدنین) جایگزین باز پورین دیگری (گوانین) شود و یا باز پیریمدین (تیمین) جای باز پیریمیدین دیگری (سیتوزین) را بگیرد، موتاسیون نقطه ای از نوع Transition است.

    جایگزینی یک پورین به جای پیریمیدین و بالعکس را موتاسیون نقطه ای Transversion می گویند. هر موتاسیون نقطه ای در اثر تغییری که در یک جفت از بازهای یکژن و معمولا در یکی از رمزهای RNA پیامبر ایجاد می کند، موجب پیدایش یکی از حالات زیر می شود:

    ۱- باعث ورود یک اسیدآمینه نامربوط (اشتباه) در زنجیره ی پروتئینی می شود و چنین پروتئینی ممکن است در مقایسه با پروتئین طبیعی، کمتر فعال و یا غیر فعال باشد. این نوع موتاسیون را Missence  می نامند.

    ۲- باعث پیدایش کد اختتام در RNA پیامبر می شود که سنتز پلی پپتیدی کوتاه تر از حد معمول و بنابراین ناقصرا به دنبال دارد. این نوع موتاسیون را Nonsence می نامند.

    ۳- با آن که یکی از سه نوکلئوتید یک رمز را تغییر می دهد ولی اسیدآمینه نامربوط وارد رشته پروتئینی نمی شود. علت این امر آنست که بعضی از اسیدآمینه ها بیش از یک رمز دارند و لذا رمز تغییر یافته، می تواند یکی دیگر از رمزهای اسیدآمینه ی مربوطه باشد. به این موتاسیون ها، خنثی (Neutral) گفته می شود.

موتاسیون برهم زننده ی کدها:

    اگر به ردیف نوکلئوتید های یک ژن یک نوکلئوتید اضافه شود ویا یک نوکلئوتید کاسته شود، تمام رمزهای موجود در RNA پیامبر به هم می خورد. علت این امر آن است که ترجمه ی رمزها از یک نقطه و در یک جهت مشخص RNA پیامبر ( از رمز AUG ) شروع می شود و به صورت واحد های سه نوکلئوتیدی ( که همان رمزهای اسیدآمینه باشند ) جلو می روند. حال اگر یک نوکلئوتید اضافی در میان رمزها واقع شود، رمزهای بعد از نوکئوتید اضافه شده، به اندازه ی یک نوکلئوتید به جلو کشیده می شود و در نتیجه ماهیت ( نوع ونظم ) همه ی رمزها عوض می شود.

    کم شدن یک نوکلئوتید از ردیف نوکلئوتیدهای یک ژن نیز چنین حالتی را بوجود می آورد. منتهی جهت به هم خوردن نظم رمزها در خلاف جهت قبلی است. این گونه موتاسیون موجب سنتز پروتئین های غیر فعال می شود، چون ردیف کاملا جدیدی از اسید آمینه در پروتئین بوجود می آید.

چگونگی وقوع موتاسیون

    موتاسیون ها در اغلب اوقات به هنگام همانندسازی DNA به وقوع می پیوندند. بعضی از موتاسیون ها حاصل صدماتی است که در اثر پرتوهای ماوراء بنفش و پرتوهای یونیزان به سلول وارد می شود. چون این عوامل از اجزاء لاینفک محیط هستند ( مثلا پرتو ماوراء بنفش از اجزاء نور خورشید است)، احتمالا موجب وقوع بسیاری از موتاسیون های خودبه خودی می باشند.

    با این وصف می توان سرعت وقوع موتاسیون را با استفاده از چنین پرتوهایی افزایش داد. هر عاملی که وقوع موتاسیون را با استفاده از چنین پرتوهایی افزایش دهد موتاسیون زا ( Motagen ) خوانده می شود. موتاسیون هایی که در اثر استفاده عمدی از مواد موتاسیون زا بوجود می آیند، موتاسیون های القایی  Induced Mutation )) نام دارند. موتاسیون های القایی ممکن است از نظر سرعت وقوع با موتاسیون های خودبخودی ( طبیعی ) تفاوت داشته باشند نه از نظر نوع موتاسیون. بعنوان مثال، اشعه ماوراء بنفش هم در شرایط طبیعی ایجاد موتاسیون می کند و هم در شرایط آزمایشگاهی، ولی تعداد موتاسیون در شرایط آزمایشگاهی بیشتر است، چون از دوز قویتر پرتوها استفاده شده است.

   پرتوهای یونیزان همچون اشعه ی ایکس و گاما می توانند با ایجاد یونهای رادیکالی همچون ^– OH و H ⁺ ، بسیاری از پیوندهای شیمیایی را تغییر و باعث شکسته شدن زنجیره یDNA شوند. پرتوهای ماوراء بنفش آسیب عمده ی خود را از طریق تشکیل دایمرهای پیریمیدین و بویژه دایمرهای تیمین، وارد می سازنند.

    علاوه بر پرتو های ایکس، گاما و ماوراء بنفش، موادشیمیایی متعددی نیز موجب وقوع موتاسیون می شوند. این مواد را بطور کلی می توان به دودسته تقسیم کرد.

    دسته اول : موادی هستند که بطور شیمیایی با بازهای DNA ترکیب می شوند و موجب تغییر شیمیایی آنها می گردند.«اسید نیترو» که موجب حذف گروه های آمین بازها می شود، مثالی از این دسته مواد شیمیایی به شمار می رود.

    دسته دوم : شبیه بازها هستند. این مواد در DNA جای باز اصلی را می گیرند ولی چون مانند بازهای اصلی نمی توانند پیوندهای هیدروژنی طبیعی تشکیل دهند، موجب پیدایش اشتباهاتی در امر همانند سازی می شوند که به وقوع موتاسیون منجر می شود.

نحوه اصلاح موتاسیون ها

    هر چند که پرتوهایی نظیر پرتو ماوراء بنفش و پرتوهای یونیزان و نیز بعضی از مواد شیمیایی به مولکول DNA آسیب می رسانند، ولی خوشبختانه سلول ها واجد آنزیم هایی هستند که می توانند آسیب های وارده را ترمیم کنند. بسیاری از باکتری ها و مخمرها دارای مکانیسم های تعمیری خاصی هستند که بوسیله نور آبی موجود در طیف نور مرئی فعال می شود و ضایعات حاصله از پرتو ماوراء بنفش را ترمیم می نمایند. این مکانیسم را اصطلاحا«Photoreactivation Mechanism» می گویند. در این مکانیسم، آنزیمخاصی بوسیله ی نور آبی فعال می شود و به دایمر تیمین می چسبد، سپس پیوندهای ایجاد شده بین دو باز را پاره می کند و به این نحو موتاسیون ترمیم می گردد. پس از ترمیم،آنزیم فوق از DNA جدا می شود.

    بعضی از باکتری ها دارای «اگزونوکلئازها» و «آندونوکلئازهای» خاصی هستند که بوسیله ی«آندونوکلئاز» می توانند قطعات آسیب دیده ی DNA را بریده و توسط «اگزونوکلئاز» آن را خارج نمایند. سپس آنزیم دیگری به اسم «DNA پلی مراز» با افزایش نوکلئوتیدهای درست، جای قطعه خارج شده را پر می کند و آنگاه «DNA لیگاز» پارگی ها را به هم متصل می کند.

انواع موتاسیون در باکتری ها

    هر یک از صفات سلول ممکن است توسط جهش تغییر یابد. جهش یافتگان زیادی از میان باکتری ها مجزا شده اند و مورد مطالعه قرار گرفته اند. بعضی از انواع مهم آن ها عبارتند از:

    ۱- جهش یافتگان مقاوم به داروی سنتتیک یا مقاوم به آنتی بیوتیک، تحمل این موتانت ها نسبت به مواد بازدارنده ی رشد ( داروی شیمیایی یا آنتی بیوتیک ) زیاد است.

    ۲- جهش یافتگانی که قدرت تخمیر قندهای خاصی در آن ها از بین می رود. مثلا در شرایط معمول، «کلی باسیل»  قادر به تخمیر قند لاکتوز است ولی در نتیجه ی جهش، گاهی نسلی از «کلی باسیل» بوجود می آید که از تخمیر لاکتوز ناتوان است. همچنین جهش یافتگانی که تولید محصولات انتهایی ( End Products) خاصی در آنها افزایش یا کاهش یافته و یا دگرگون شده است. این موضوع در صنعت اهمیت زیادی دارد. بعنوان مثال، در اثر مجزا کردن نوعی کپک پنی سیلیوم جهش یافته، توانسته اند تولید پنی سییلین را به نحو قابل ملاحظه ای افزایش دهند.

    ۳- جهش یافتگانی که از نظر غذایی ناتوان هستند ، یعنی محیط رشد آن ها باید کامل تر از محیط رشد تیپ وحشی آن ها باشد.

    ۴- جهش یافتگانی که در اثر جهش آنتی ژن های سطحی آنها، یا شکل کلنی یا قدرت تولید پیگمان در آن ها تغییر نموده است. مثلا کلنی غالب باکتری های گرم منفی پس از خروج باکتری از بدن و رشد در روی محیط کشت، دارای ویژگی صاف و آبدار یا کلنی  S(  Smooth) است. ولی گاهی در نتیجه ی تکرار کشت ( روپیکاژ ) بر روی محیط های مختلف، صفات خشک و خشن یا کلنی R(Roug) را کسب می کند. این تغییرات می تواند در نتیجه ی از دست دادن آنتی ژن پیکری (سوماتیک) ایجاد شود که البته گاهی منشاء محیطی دارد و نه منشاء ژنوتیپی. همچنین استافیلوکوک اورئوس، پیگمان طلایی رنگی می سازد که کلنی را به رنگ زرد در می آورد ولی گاهی در نتیجه ی جهش، این خاصیت باکتری از بین رفته و باکتری دیگر قادر به ساختن ماده ی ذکر شده نخواهد بود. بروز چنین حالتی دائمی است و با حالتی که استافیلوکوک در غیاب هوا قادر به ساختن پیگمان نمی باشد متفاوت است.

    ۵- موتان هایی که در برابر باکتریوفاژها از خود مقاومت نشان می دهند.

    ۶- جهش یافتگانی که در آن ها بعضی از خصوصیات مورفولوژیکی، نظیر اسپورزایی، تولید کپسول و یا تاژک، تغییر نموده است.

نو ترکیبی

    نوترکیبی، نتیجه ی انتقال ژن در باکتری هاست. سه نوع انتقال ژن در باکتری ها موجب نوترکیبی ژنی می شود:

    ترانسفورمیشن یا انتقال بدون واسطه (Transformation  )

    ترانسداکشن یا انتقال با واسطه ( Transduction )

    کانجوگیشن یا هم یوغی ( Conjugation )

ترانسفورمیش

    ترانسفورمیشن پدیده ای است که طی آن قسمت کوچکی از DNA آزاد شده، از یک یاخته به یاخته دیگر منتقل می شود. در اثر تجزیه ی طبیعی سلول و یا به طریق شیمیایی، می توان DNA دهنده را از سلول جدا نمود. در انتقال بی واسطه، نوترکیبی هنگامی صورت می گیرد که DNA وارد سلول پذیرنده شده باشد. باکتری هایی که ژن های حاوی صفات خاصی را از باکتری دهنده دریافت داشته اند، تغییریافته (Transformed) خوانده می شوند.

    بنابراین مواقعی که بعضی از باکتری ها در مجاورت سویه های خویشاوند نزدیک یا صاف شده ی کشت ( Culture filtrate ) یا عصاره ی آن ها رشد می کنند،‌یک یا چند صفت ار صفات سویه ی خویشاوند را کسب و در ادامه، به گونه های نزدیک منتقل خواهند کرد.

   ترانسفورماسیون باکتریایی برای اولین بار توسط گریفت در ۱۹۲۸ توصیف شد. این اولین کشف مهم در زمینه ی ژنتیک مدرن بود، زیرا نه تنها توصیف کرد که انتقال ژنتیکی از یک باکتری به باکتری دیگر ممکن است، ‌بلکه در ادامه منجر شد به فهم این مهم که ماده ی ژنتیکی فقط DNA است. گریفت برای توصیف ترانسفورماسیون و اثبات انتقال ژنتیکی صفات در باکتری ها، این آزمایش را انجام داد:

    ۱-  به گروهی از موش ها، ‌استرپتوکوکوس پنومونیه ی بدون کپسول ( تیپ ۲ ) و زنده را تلقیح کرد.

    ۲- به گروه دومی از موش ها، پنوموکوک کپسولدار ( تیپ ۱ ) کشته شده در اثر گرما را تلقیح کرد.

    ۳- به گروه سوم موش ها، مخلوطی ازارگانیسم های بدون کپسول زنده ( تیپ ۲) و باکتری های کپسول دار کشته شده در اثر حرارت ( تیپ۱) را تلقیح کرد.

    بعد از یک تا دو روز گریفت مشاهده کرد که موش های گروه اول و دوم زنده مانده اند و موش های گروه سوم در اثر سینه پهلوی پنوموکوکی مرده اند. بعلاوه وقتی گریفت، استرپتوکوکوس پنومونیه را از موش های مرده جدا سازی کرد، از نوع « تیپ ۱» و زنده بود. با توجه به این که پنوموکوک های کپسول دار (تیپ ۱) قبل از تزریق به داخل موش کشته شده بودند، این پنوموکوک های کپسولدار (تیپ۱) ، از کجا آمده بودند؟ تنها پاسخ این بوده است که ماده ی ژنتیکی قادر بوده است از ارگانیسم های « تیپ ۱» کشته شده به داخل اورگانیسم های« تیپ ۲» گذر کند و این سلول را به سلول های کپسول دار تغییر شکل دهد.

    ۱۶ سال بعد، آوری ( Avery )، مک لود (McLeod) و مک کارتی (Mc Carty ) نشان دادند که عامل این تغییر،DNA است.

طبیعت  DNA  در طی ترانسفورماسیون

    وقتی DNA کروموزمی از یک اورگانیسم دهنده خارج می شود و برهنه می گردد، ‌کروموزوم مذکور به ۲۰۰ تا ۵۰۰ قطعه تقسیم می شود. باکتری گیرنده قادر است حداکثر ۱۰ تا از این قطعات را جذب کند. بنابراین مقدار DNAای که در هر ترانسفورماسیون دخیل است، به نظر می رسد در بیشتر موارد، ۵-۲ درصد کل DNA دهنده است. فقط DNA دو رشته ای قابلیت انتقال خواهد داشت.

خصوصیات سلول گیرنده

    باکتری ها فقط در شرایط خاصی قابلیت ترانسفورم شدن ( تغییر یافتن ) را دارند. در ارگانیسم های گرم مثبت همچون استرپتوکوک و باسیلوس، سلول های گیرنده، ساختمان های پروتئینی سطحی خاصی را تشکیل می دهند که DNA ی در حال انتقال به آن ها جذب شده و می چسبد. سلول هایی که توانایی دارند چنین ساختمان های پروتئینی خاصی را تشکیل دهند،« کمپتانت » نامیده می شوند. DNA دو رشته ای به پروتئین های قرار گرفته در سطح سلول های کمپتانت، اتصال می یابد و با یک روند وابسته به انرژی به داخل سلول گیرنده منتقل می شود. پس از ورود DNA، یکی از رشته های DNA دهنده متلاشی می شود. رشته دیگر با قسمت های همتایی ( همولوگ ) از کروموزم گیرنده ، ایجاد جفت بازهای مکمل می کند و سپس در DNA گیرنده ادغام می شود. ینابراین DNA جذب شده با ساختمان DNA سلول گیرنده، شباهت و خویشاوندی نزدیکی دارد. در غیر این صورت ، DNA به داخل کروموزوم گیرنده الحاق نخواهد شد و در نتیجه بیان نیز نخواهد گشت.

    در باکتری های گرم منفی، همچون هموفیلوس و نیسریا نیز ساختمان های پروتئینی اختصاصی بر روی سطح خارجی وجود دارد که به سلول حالت «کمپتانس»  می دهد. حالت کمپتانس در باکتری های گرم منفی باعث می شود که هم DNA همولوگ و  هم هترولوگ، به باکتری گیرنده بچسبند. اما ورود DNA بداخل سلول، اختصاص به گونه های همولوگ دارد و DNA هترولوگ به داخل راه نمی یابد. بعد از ورود، DNA دو رشته ای فوراً می تواند بیان شود، اما به منظور بقاء  قطعه DNA اکتسابی جدید در داخل سلول، لازم است که اینDNA به کروموزوم میزبان الحاق شود.

ترانسداکشن

    برای فهم ترانسداکسیون، ابتدا لازم است که با باکتریوفاژها آشنا شویم.

    باکتریوفاژ: ویروس هایی هستند که فقط قادرند در باکتری ها تکثیر یابند. هر باکتریوفاژ فقط میزبان باکتری های خاصی است. ساختمان باکتریوفاژ معمولا از دو قسمت اصلی تشکیل شده است(تصویر۱-۹):

    ۱- هسته ( Core ): که از جنس اسید نوکلئیک است و بوسیله ی یک پوشش پروتئینی به اسم کپسید  ( Capsid ) پوشانده شده است.

    ۲- دم ( Tail ): که از خلال آن، اسید نوکلئیک خود را به داخل میزبان تزریق می کند. دم ممکن است که در سطح خود، غلاف دمی و در انتهای خود، رشته های دمی را دارا باشد. رشته های دمی ( Tail fibers ) باعث اتصال فاژ به گیرنده ی خاصی در سطح باکتری میزبان می شوند.

     باکتریوفاژها به دو تیپ عمده ی: ۱- لیتیک یا ویرولانت  ۲- آرام ( Temperate ) یا لیزوژن یا غیر ویرولانت تقسیم می شوند. اگر باکتری توسط یک فاژ لیتیک آلوده شود، فاژ مذکور با به خدمت گرفتن DNA و سیستم آنزیمی باکتری، تعداد زیادی ویروس های مشابه خود را همانند سازی و مونتاژ خواهد نمود و در نهایت در اثر کثرت و فراوانی ویروس ها، باکتری میزبان لیز خواهد شد و تعداد زیادی فاژ جدید از آن آزاد می گردد تا یاخته های دیگر را آلوده نماید. به این جریان، چرخه ی انهدامی یا چرخه ی لیتیک گفته می شود. اما اگر یک باکتری توسط فاژ آرام آلوده شود، نتیجه ی امر بزودی مشخص نمی شود. زیرا اسید نوکلئیک ویروس در سلول میزبان الحاق می شود و از نسلی به نسل بعدی انتقال می یابد، بدون این که موجبات انهدام سلول فراهم گردد. به ابن حالت، کنورسیون لیزوژنی می گویند. (تصویر ۲-۹)

    ژنوم فاژ را در این حالت پروفاژ می نامند. در عین حال ممکن است فاژهای آرام خودبخود و یا در اثر القاء محیطی، عفونت زا شوند. یعنی یکباره ژنوم ویروس الحاق شده درDNA میزبان، بطور خودمختار و بطور پی در پی همانند سازی می نماید و در ادامه بیان می گردد و تعداد زیادی کپسید و دم ویروس حاصل می آید و در نهایت میزبان خود را منهدم می نماید.

    ترانسداکسیون ابتدا در سال ۱۹۲۵ توسط «نورتون زیندر» و «جوشوالیدبرگ» توصیف شد. این روش، دومین شیوه برای انتقال ماده ژنتیکی از یک باکتری اولیه به یک باکتری ثانویه است. اما در این روش، DNA برهنه مشابه آن چه در ترانسفورماسیون مشاهده شد، انتقال نمی یابد و بلکه ترانسداکسیون پدیده ای است که طی آن ژنها بوسیله باکتریوفاژ از یک باکتری به باکتری دیگر انتقال می یابند.

    وقتی یک باکتریوفاژ ( گاهی فاژ نامیده می شود ) یک باکتری را آلوده می کند، فاژ در ابتدا به گیرنده های اختصاصی در سطح باکتری جذب می شود. سپس اسید نوکلئیک خود را بداخل سیتوپلاسم باکتری تلقیح می کند، در این لحظه، بسته به نوع فاژ یکی از دو حالت زیر رخ می دهد:

ترانسداکشن عمومی (Generalized Trans ):

    ممکن است اسید نوکلئیک فاژ بدون آن که به داخل ژنوم باکتری الحاق شود، ماشین عمومی باکتری را به خدمت خود بگیرد و آنزیمی را کد گذاری نماید که DNA باکتری را به قطعات کوچک تقسیم کند و سپس در جهت سنتز بیشتر اسید نوکلئیک فاژ و پوشش های پروتئینی فاژ عمل کند.

    در طی مراحل مونتاژ یا وصل شدن قطعات مختلف ویروسی به یکدیگر، ممکن است قطعه ای از کروموزم باکتریال میزبان به داخل کپسید ویروسی وارد شود. چنین فاژهایی که همراه با دیگر فاژها از باکتری های آلوده رها می شوند از نظر ظاهری مشابه به ذرات فاژ طبیعی هستند. اگر این فاژ حاوی ژنوم باکتریایی به سطح باکتری دیگر جذب شود، می تواند محتوی DNA خود را به داخل باکتری پذیرنده تلقیح کند و به این ترتیب بخشی از اطلاعات ژنتیکی یک باکتری به باکتری دیگر انتقال می یابد. (تصویر ۳-۹)

    از آن جا که در این نوع ترانسداکسیون، هر بخشی از DNA کروموزومی و نیز DNA غیر کروموزومی باکتری ممکن است وارد ذره ویروسی شود و به سلول دیگر انتقال یابد، این فرایند را با عنوان ترانسداکسیون عمومی می نامند. فراوانی چنین فاژهایی که به اشتباه ژنوم باکتریایی را در خود جای می دهند، حدود ۳/۰درصد کل فاژهایی است که در داخل باکتری بسته بندی می شوند. از آن جا که مقدار DNA باکتری که می تواند در داخل سر یک فاژ بسته بندی شود، فقط حدود ۲درصد کل کروموزوم باکتری است، بنابراین  فقط ژنهایی می توانند در یک  فاژ منفرد، همراه با هم انتقال یابند که نزدیک به هم قرار گرفته اند. با تعیین فراوانی ژن هایی که بصورت همراه با هم انتقال می یابند می توان ترتیبشان را در طول کروموزوم باکتری تعیین کرد.

ترانسداکشن محدود(RestrictedTrans ):

    ترانسداکسیون محدود فقط در موقعیت هایی رخ می دهد که پروفاژ به داخل یک مکان اختصاصی در کروموزوم میزبان الحاق می شود. الحاق فاژ لامبدا ( Phage ) در کروموزوم اشرشیاکلی، از این زمره است. در این حالت ابتدا  DNAفاژ، یک پروتئین مهارکننده ( Repressor ) را کد و سپس آن را بیان می کند و به این وسیله از کپی برداری  DNAفاژ به شکل mRNA پیشگیری می کند. بنابراین آنزیم تخریب کننده ( قطعه قطعه کننده ) DNAی باکتری ساخته نمی شود. همچنین کپسیدهای فاژی ساخته نمی شوند و اسید نوکلئیک فاژ نیز فقط همزمان با همانندسازی DNA باکتری همانند سازی می شود. در چنین فاژهای معتدل، گاهی پروتئین ممانعت کننده در پیشگیری از نسخه برداری پروفاژ ناتوان می شود که نتیجه ی آن تشکیل ذرات فاژ بالغ است. در توالی معمول در داخل باکتری اشرشیاکلی، ژنوم فاژ لامبدا تشکیل یک حلقه می دهد و از کروموزوم باکتری جدا می شود. همانند سازی های بعدی فاژ و نسخه برداری از DNA فاژ و سنتز تعداد زیادی کپسید در داخل باکتری، باعث آزادسازی تعداد فراوانی اژ لامبدای بالغ می شود.

    در عین حال حدودا از هر یک میلیون فاژی که به این روش تولید می شوند، در یک مورد نیز اشتباها بخشی از ژنوم باکتری در دو طرف ژنوم فاژ جای گرفته است. از آنجا که چنین فاژهایی هنوز می توانند به داخل کروموزوم اشرشیاکلی دیگری الحاق شوند، بنابراین باعث انتقال خصوصیات ژنتیکی باکتری اشرشیاکلی اولیه به باکتری اشرشیاکلی بعدی خواهند شد. در این نوع ترانسداکسیون، انتقال ژن های باکتری های دهنده، محدود به آن ژن هایی می شود که در زمان الحاق پروفاژ، در ژنوم باکتری، مجاور پروفاژ بوده اند. بنابراین تعداد ژن های مذکور محدود است. به این جهت به نام ترانسداکسیون محدود نامیده می شود.

کانژوگیشن (هم یوغی)

     کانژوگاسیون یا هم یوغی عبارت است از انتقال DNA از یک باکتری دهنده به یک باکتری گیرنده، از طریق تماس مستقیم دو سلول باکتری. کارایی این مکانیسم در انتقالDNA خیلی بیشتر از ترانسفورماسیون یا ترانسداکسیون است. بعلاوه سلول دهنده در طی فرایند مذکور تخریب نمی شود.

در این انتقال، سلول های دهنده با سلول های پذیرنده، از آن جهت متفاوتند که محتوی یک پلاسمید می باشند. در کانژوگاسیون ممکن است پلاسمید یا قطعات بزرگی از کروموزوم و در موارد خاصی تمام کروموزوم،از سلول دهنده به سلول گیرنده منتقل گردد.(تصویر۴-۹)

    پدیده ی کانژوگاسیون برای اولین بار در سال ۱۹۴۶ توسط « لدربرگ»        ( Lederberg ) و « تاتوم»                ( Tatum ) نشان داده شد.

     این دو دانشمند دو سویه از جهش یافتگان اشرشیاکلی را که هر یک توانایی سنتز یک یا چند ماده ی غذایی اساسی را از دست داده بودند، با هم مخلوط نمودند تا بین آن ها تماس فیزیکی برقرار شود. سپس مخلوط حاصل را برروی محیط کشت «حداقل» که فقط مناسب رشد تیپ وحشی بود کشت دادند. محققین فوق با یافتن کلنی های تیپ وحشی برروی محیط کشت مذکور، دریافتند که این امر باید حاصل نوترکیبی ژنتیکی از طریق کانژوگاسیون بوسیله سویه های  جهش یافته باشد.

پلاسمید ( Plasmid )

    در باکتری ها علاوه بر کروموزوم، عناصر غیر کروموزومی از جنس DNA دو رشته ای نیز وجود دارد. به این عناصر که قادرند بطور مستقل در سیتوپلاسم باکتری همانندسازی نمایند، پلاسمید می گویند. پلاسمیدها شکل حلقوی دارند و در صورتی که با اندازه ی کروموزوم باکتری مقایسه شوند، حدود ۱/۰ تا ۵/۰ طول کروموزوم می باشند. پلاسمیدها را به دو گروه کلی تقسیم می کنند. پلاسمیدهای دارای توانایی انتقال خود ( کانژوگاسیون ) و پلاسمیدهای فاقد توانایی انتقال. بطورکلی، پلاسمیدهای فاقد توانایی انتقال، کوچک هستند ( ۲۰-۳ میلیون دالتون ) و به تعداد زیاد ( ۶۰-۱۰ کپی ) در داخل سلول باکتری حضور دارند. این پلاسمیدها دارای قدرت همانندسازی هستند و همانندسازی آن ها بیش از همانندسازی کروموزوم رخ می دهد.

    در مقابل، پلاسمیدهای قادر به انتقال خود، بزرگ هستند ( ۱۰۰-۴۰ میلیون دالتون ) و توسط آنزیم های مشابهی با همانندسازی کروموزوم تکثیر می یابند. تعداد آن ها در سلول معمولا به تعداد ۳-۱ کپی است و همزمان با کروموزوم همانندسازی می کنند. چنین پلاسمید هایی مجموعه ای از ژن ها به نام ژن های tra را حمل می کنند که کد کننده ی پیلی جنسی و آنزیم های انتقال دهنده ی DNA می باشند. ژن های tra در پلاسمیدهای فاقد توانایی انتقال، وجود ندارند.

    پلاسمیدها کد کننده ی اعمالی هستند که لازمه ی حیات سلول نیست، اما قابلیت های متابولیکی مفیدی را برای سلول مهیا می کنند. پلاسمیدها در طبیعت بطور وسیع پراکنده اند و غالب باکتری های جدا شده از موارد بالینی، محتوی حداقل ۱ و اغلب ۶ پلاسمید مختلف هستند. آن ها، هم در باکتری های گرم مثبت و هم گرم منفی وجود دارند و بر حسب اعمالی که کد می کنند طبقه بندی می شوند. پلاسمیدها ممکن است حاوی ژن های مقاومت به نمک های جیوه و نقره باشند. یا کد کننده ی آنزیم هایی باشند که در هنگام تابش پرتو ماوراء بنفش، نقش تعمیر کننده ی DNA را دارا است. همچنین تولید پیلی و فیمبریه نیز توسط پلاسمید کد می شود. تولید همولیزین در اشرشیاکلی، آنترتوکسین مسئول اسهال و خیلی از اگزوتوکسین های دیگر، همچون توکسین مسئول بوتولیسم، کزاز و تب مخملکی، توسط پلاسمیدها کد می گردند.

    ویژگی های دیگر، مثل توانایی تثبیت ازت در باکتری« ریزوبیوم » و توانایی تجزیه ی مولکول های نفت در بعضی از « پسودوموناس »ها نیز در ساختمان پلاسمید کد گذاری شده است. پلاسمید بعضی از باکتری ها، عوامل باکتریوسینوژنیک (Bacteriocinogenic) هستند، یعنی ساختمان پروتئین هایی را هدایت می کنند که موجب مرگ دیگر باکتری های همگونه یا گونه های نزدیک می شوند. این پروتئین ها را به طور کلی، باکتریوسین (Bacteriocine) می خوانند. باکتریوسین اشرشیاکلی را«کلی سین»(Colicine) و باکتریوسین گونه های پسودوموناس را« پیوسین» (Pyocine) می نامند. عامل R که موجب مقاومت بعضی از باکتری ها در مقابل تعدادی از آنتی بیوتیک ها می شود، نیز جزء پلاسمیدها به حساب می آید. بعضی از عوامل R می توانند از طریق کانژوگاسیون به سلول های دیگر منتقل شوند. پلاسمیدها همچنین ممکن است هیچ یک از اعمال متنوعی که برای بقای باکتری کمک کننده است را کد نکنند اما همه ی آن ها حداقل دارای توانایی همانندسازی خودشان هستند.

    کاسمید (Casmid):از ادغام ژنوم باکتریوفاژ و پلاسمید حاصل می شود و در نوترکیبی ژنتیکی کاربرد بسیار دارد.

انتقال پلاسمید

    کانژوگاسیون یک فرایند یک طرفه است و برخلاف سلول های یوکاریوت، نتیجه ی به هم پیوستگی کامل دو سلول برای تشکیل سلول های  دیپلوئید نیست. در کانژوگاسیون،  باکتری دهنده، محتوی یک پلاسمید است که دارای« ۲۵-۱۵»  ژن اولیه ی انتقال پلاسمید می باشد و چنانچه گفته شد، به نام ژنهای tra نامیده می شوند و مخصوص انتقال پلاسمید هستند، یعنی ساختمان ها و آنزیم های مورد نیاز جهت وقوع کانژوگاسیون را کد می کنند. یکی از ساختمان های ضروری کد گذاری شده توسط ژن های tra، پیلی جنسی است.

    در هر سلول دهنده، بین «۱۰-۳»  پیلی جنسی وجود دارد. قطعه ای از پلاسمید که حاوی ژن های tra می باشد به نام فاکتور جنسی (F- Factor) نامیده می شود و هر باکتری که در سیتوپلاسم خود دارای پلاسمید حاوی فاکتور F باشد، باکتری نر نامیده می شود و با F⁺ نشان داده می شود. سلول هایی که در فرایند کانژوگاسیون گیرنده یDNA  هستند، با علامت ^–F  نشان داده می شوند. این سلول ها فاقد پلاسمید حاوی فاکتور F می باشند.

پلاسمید طی مراحل زیر به باکتری گیرنده انتقال می یابد :

    ۱- پیلی جنسی با یک گیرنده که بر روی سطح سلول پذیرنده وجود دارد، واکنش می کند.

    ۲- در اثر تحریک حاصل از تماس با سلول گیرنده،  پیلی جنسی به داخل سلول دهنده پس زده می شود و در نتیجه سلول دهنده را در تماس نزدیک با سلول گیرنده قرار می دهد.

    ۳- یک نوکلئاز توسط ژن پلاسمیدی tra سنتز می شود. این نوکلئاز حلقه یDNA پلاسمید را در یک مکان خاصی که نقطه ی شروع انتقال است، می شکند.

    ۴- سپس انتهای ۵َ آزاد زنجیره ی پلاسمید باز شده و در داخل پیلی جنسی به سمت سلول گیرنده کشیده می شود و احتمالا در این مسیر توسط دیگر آنزیم هایی که توسط ژنهای traکد می شوند هدایت می گردد.

    ۵- زنجیره  ی DNA انتقال یافته و زنجیره یDNA باقیمانده در سلول دهنده، بطور طبیعی توسط آنزیم DNA پلی مراز سلول  همانندسازی می شوند و در نتیجه کپی های حلقوی دو رشته ای در هر دو سلول ایجاد می کنند.

    ۶- به دنبال انتقال DNA، پل ارتباطی تخریب می شود و دو سلول جدا می شوند.حال ژن های tra در سلول پذیرنده بیان می شوند. بنابراین آن سلول نیز اینک یک سلول دهنده ( سلول  F⁺ ) می باشد.

    با روش فوق، پلاسمیدها به سرعت در داخل جمعیت های باکتریایی گسترش می یابند.

    برخلاف ترانسفورماسیون و ترانسداکسیون که انتقال و بیان DNA ، فقط در بین ارگانیسم های کاملا نزدیک به هم رخ می دهد، انتقال پلاسمید توسط کانژوگاسیون از اختصاصات خیلی کمتری برخوردار است. در حقیقت بعضی پلاسمیدهای میزبان می توانند خودشان را به گونه های خیلی متفاوت انتقال دهند.

انتقال کروموزوم

    چنانچه گفته شد، کانژوگاسیون بین سلول F⁺ و سلول^–F، باعث انتقال سریع پلاسمید حاوی فاکتور F به سلول F^–می شود و آن را به سلول F⁺ تغییر می دهد. با این وجود در موارد نادر پلاسمید F یک باکتری به کروموزوم همان باکتری الحاق می شود. چنین سلول هایی قادرند کروموزوم خود را در این شرایط انتقال دهند. این سلول های دهنده را به نام  High Frequency of Recombination ( HFR ) می نامند، زیرا انتقال چنین کروموزوم هایی با نوترکیبی فراوان در سلول گیرنده همراه است. انتقال کروموزوم از باکتری HFR، از مکانی که فاکتور F الحاق شده است و بلافاصله بعد از آن آغاز می شود. یکی از رشته های DNA کروموزوم باز می شود و همزمان انتقال می یابد. انتقال تمام کروموزوم به حدود ۱۲۰ دقیقه وقت نیاز دارد. اما انتقال کروموزوم معمولا کامل نیست و احتمال این که یک ژن مشخص انتقال یابد وابسته به فاصله ی آن ‍ژن تا مکان شروع انتقال، می باشد. هرچه این ژن از مکان انتقال کروموزومی دورتر باشد، انتقال آن به زمان بیشتری نیاز دارد. ژن های tra که الحاق کننده ی فاکتور F در کروموزوم هستند، آخرین ژنهایی می باشند که انتقال می یابند. معمولا قبل از انتقال تمامی ژنوم، کانژوگاسیون در اثر تصادف گسسته می شود. بنابراین ژن های انتهایی باکتری HFR به ندرت انتقال می یابند. چون برای تبدیل  ^–F به HFR،انتقال تمام ژن های tra (فاکتور F ) لازم است، به همین دلیل پس از کانژوگاسیون، اغلب باکتری های گیرنده ی کروموزوم HFR، کماکان بصورت  F^–باقی می مانند.(تصویر۷-۹)

                                  HFR × F^–  F^–

    بطور خلاصه، در لقاح بین باکتری HFR و باکتری F^–، فراوانی انتقال فاکتور F بسیار کم است ولی نوترکیبی حاصل بسیار بالاست. برعکس در لقاح بین باکتری F^– و F⁺، فراوانی انتقال فاکتور F           « ۱۰۰% » و فراوانی نوترکیبی بسیار اندک است ( یک نوترکیبی در۱۰^۵– ۱۰^۴ باکتری )، زیرا در این نوع لقاح، انتقال فقط شامل انتقال پلاسمید است و نه کروموزوم . چون پلاسمید تعداد ژن محدودی دارد، بنابراین طبیعی است که فراوانی نوترکیبی های حاصل کم خواهد بود.

تعیین نقشه ی ژنتیکی با کمک کانژوگاسیون

    نظم انتقال کروموزوم از باکتری HFR به باکتری F^– را می توان از طریق گسستن آمیزش تعیین نمود. برای این منظور ابتدا باکتری هایHFR و F^– را باهم مخلوط می کنند ، سپس در زمانهای مختلف و با استفاده از به هم زدن، در امر کانژوگاسیون گسستگی ایجاد می کنند ( ارتباط فیزیکی دو سلول را قطع می کنند )، سپس سلول ها را در محیط های کشت انتخابی سفت رشد می دهند تا نوترکیبی هایی که قبل از ایجاد گسستگی بوجود آمده اند مشخص شوند. با تعیین فراوانی نوترکیبی ژن ها و مشخص کردن زمان انتقال هر ژنبه باکتری F^–، می توان نقشه ی ژنتیکی کروموزوم HFR را تعییین نمود. باید دانست، این امر به آن علت امکان پذیر است که کروموزوم HFR، علیرغم حلقوی بودن، به طریقه ی خطی به F^– انتقال می یابد. این بدان معنی است که عامل F^– ادغام شده در کروموزوم، نه تنها نقش گشودن حلقه کروموزوم را دارد، بلکه قسمتی از آن بعنوان مبداء انتقالDNA عمل می کند.

سلولهای َF   

    پلاسمید می تواند در داخل کروموزوم الحاق شود و مجدد در هنگام ضرورت، فرایند معکوس رخ دهد و پلاسمید از کروموزوم خارج شود. در صورتی که هنگام خارج شدن پلاسمید از کروموزوم، جدا شدن بطور غیر طبیعی انجام شود، ممکن است بخشی از ژن های کروموزوم که در زمان الحاق پلاسمید در یک یا هر دو سمت پلاسمید قرار گرفته اند نیز به همراه پلاسمید از کروموزوم جدا شوند. چنین پلاسمید هایی به نام پلاسمید َF اولیه نامیده می شود.

    پلاسمید َF نیز می تواند به همان سرعت پلاسمید F⁺، به دیگر باکتری ها انتقال یابد. در صورت انتقال، چنین پلاسمیدی به نام پلاسمید َF ثانویه نامیده می شود. بنابراین تشکیل پلاسمیدَF ، روش دیگری برای پراکنده شدن ژن های کروموزومی در جمعیت های باکتریایی می باشد.

کانژوگاسیون در باکتری های گرم مثبت

    کانژوگاسیون همچنین در بعضی از باکتری های گرم مثبت رخ می دهد. اما به نظر می رسد مکانیسم آن از آن چه در باکتری های گرم منفی اتفاق می افتد متفاوت است. شواهدی برای حضور پیلی جنسی وجود ندارد، در عوض سلول های دهنده با شناسایی یک « فرومون» که توسط سلول های پذیرنده ی مناسب تولید شده است، تحریک می شوند و یک ماده ی چسبنده تولید می کنند. ماده ی چسبنده باعث اتصال سلول های دهنده و پذیرنده می شود و انتقال DNA رخ می دهد. در عین حال مکانیسم این نوع انتقال روشن نیست.